Конспект лекцій дисципліни «основи біотехнології рослин» - страница 3

Тема: Регенерація рослин шляхом соматичного ембріогенезу


  1. Явище соматичного ембріоїдогенезу та його види;

  2. Загальні принципи одержання калусної тканини;

  3. Технологія вирощування рослин-регенерантів шляхом соматичного ембріоїдогенезу;

  4. Природа сомаклональної мінливості;

  5. Методи ідентифікації сомаклонів та практичне використання і перспективи сомаклональної мінливості.



1. Явище соматичного ембріоїдогенезу характеризується утворенням зарадкоподібних структур (ембріоїдів) нестатевим шляхом із соматичних клітин рослин. Розрізняють прямий і непрямий шляхи соматичного ембріоїдогенезу.

^ Прямий соматичний ембріоїдогене�� – це процес формування вегетативного зародка з тканин експланта без проміжної стадії утворення калусної тканини. Такі зародки в природних умовах розвиваються за рахунок клітин нуцелуса, а інколи й покривів (без будь-якого зв’язку із зародковим мішком) і носять характер додаткової (адвентивної) ембріонії. Такий вид апоміксису (аспорія) зустрічається у мандарина, лимона, апельсина і зумовлює багаттозачатковість (поліембріонію), внаслідок чого утворюється до 20 зародків, але нормально розвивається 1-4, решта – відмирають. Це явище використовується в умовах ін вітро: нуцелус незрілих плодів лимонузвільняють від інтегументів і висаджують халазною частиною на агаризоване поживне середовище. Соматичні зародки утворюються безпосередньо з клітин нуцелуса, що культивуються.

Методи ефективного одержання зарадкоподібних структур шляхом прямого соматичного ембріоїдогенезу знаходяться у стані пошуку.

^ Непрямий соматичний ембріоїдогенез передбачає утворення ембріоїдів з клітин калусної тканини і складається з таких етапів:

  1. введення експланта в культуру ін вітро;

  2. стимуляція росту калуса і формування презародків;

  3. індукція формування біполярних зародків з презародків.

Індукція соматичних ембріоїдів вже одержана в культурах клітин і тканин близько 140 видів рослин.

2. Калус («калюс»), від лат. calus – мозоль – це особливий тип тканини рослин, яка утворюється на місці поранення і сприяє заживанню. Тканина закриває місце поранення і накопичує поживні речовини, необхідні для регенерації спеціального захисного шару. В калусній тканині можуть утворюватисьзачатки органів, що доповнюють або відновлюють цілісність організму.

^ Калусні клітини – це дедиференційовані клітини, в які перетворюються спеціалізовані і меристематичні клітини при їх культивуванні на специфічних поживних середовищах ін вітро. Калусна тканина має вигляд аморфної маси тонкостінних паренхимних клітин без визначеної анатомічної структури. Клітини калусу мають велике ядро, високий вміст ДНК і РНК; деякі клітини здатні накопичувати крохмаль і речовини вторинного метаболізму. Колір тканин може бути білим, жовтим, зеленкуватим, червонуватим, що залежить від виду рослини, типу експланта, умов культивування.

Калусні клітини можна невизначено довго вирощувати ін вітро. Для цього необхідні періодичні пересадки (пасажі) невеликої частини утворених клітин на свіже поживне середовище через кожні 3-4 тижні. Найбільш «старим» вважають штам клітин, одержаний з коренеплоду моркви Роже Готре ще у 1938 році і який по сьогоднішній день вирощують у багатьох лабораторіях світу.

Для індукції калусоутворення стерильні експланти (листки, черешки, сегменти стебел, корінців тощо) нарізують і поміщують на поживне середовище з високим значенням співвідношення ауксин/цитокінін: ауксину в середовищі повинно бути у 5-10 разів більше, ніж цитокініну. Наприклад, концентрація 2.4 Д (1-3 мг/л), а БАП (0,1-0,5 мг/л). Експлант трохи вдавлюють в агар для забезпечення надійного контакту. Кінчики коренів легко утворюютть калус при їх горизонтальному розміщенні в агарі, тоді як сегменти листка – при вертикальному. Пробірки, склянки або чашки Петрі витримують у темноті при 25ºC (інколи вирощують на світлі). У перші 4-5 днівспостерігається розтягування клітин і збільшення розмірів експланта, а потім, за рахунок інтенсивних мітотичних ділень, починає утворюватись калусна тканина.

Перехід спеціалізованих клітин у стан неорганізованого росту пов’язаний із синтезом білка в клітинах, збільшенням вмісту РНК, зникненням хлоропластів і хромопластів. При оптимально підібраному середовищі сегменти утворюють калус через 3-8 тижнів.


3. Тотипотентність дедиференційованих калусних клітин обумовлює їх здатність в певних умовах повертатись до ембріонального стану і давати початок рослинам-регенерантам. Таке перетворення відбувається після перенесення невеличких частин калусних тканин на середовище з рівним співвідношенням ауксин/цитокінін, а потім - на середовище без фітогормонів. Відпрацювання методики одержання ембріогенного калусу та індукції ембріоїдів обов’зково передбачає підбір середовища і вибір експланта для конкретного виду або сорту рослин. Крім того, перші пасажі калусних культур мають більш високий морфогенетичний потенціал, який поступово втрачається при тривалому культивуванні.

Електронномікроскопічні спостереження за процесом формування ембріоїдоподібних структур на калусній масі свідчать, що спершу з’являються бугорчасті утворення, подібні до апексів. Як правило, ембріоїди проходять три стадії розвитку: глобулярну, серцевидну і торпедовидну.

Соматичні ембріоїди легко відокремлюються від калусної маси і пересаджуються на інше поживне середовище для одержання з них рослин-регенерантів. Ембріоїди виникають з поверхневих клітин і мають одноклітинне походження. Ембріогенні клітини відрізняються більш щільною цитоплазмою, відносно великим ядром і значною кількістю рибосом. Відмічають також, що перетворення калусної клітини в ембріогенну супроводжується перерозподілом у неї мікротрубочок: хаотичне розміщення мікротрубочок змінюється на їх лінійну орієнтацію паралельно вісі клітини.

Таким чином, походження зарадкоподібних структур серед клітин калусної тканини не пов’язане з мейозом та подвійним заплідненням.


4. Рослини-регенеранти, які одержані шляхом соматичного ембріоїдогенезу, називають сомаклонами (синонім – сомаклональними варіантами). У 1981 році Р.Чалеф запропонував символ R для рослин-регенерантів, одержаних з культур клітин або тканин. Самозапилені нащадки рослини R0 позначаються R1; наступні покоління від самозапилення – R2, R3 і т.д. Це пояснюється необхідністю прийняття універсальної номенклатури для регенерантів і проведення генетичного аналізу їх нащадків. Поява сомаклонів, що мають генетичні відмінності від материнської рослини, обумовленна існуванням сомаклональної мінливості. Це явище було відкрите на початку 80-х років і вважається одним із перспективних напрямків індукції мінливості в культурі ін вітро. Невизначеність генотипів ембріоїдів, з яких утворюються сомаклональні варіанти, обумовлює їх потенційну цінність для поліпшення існуючих сортів рослин.

Природа виникнення сомаклональної мінливості пояснюється двома основними причинами:

Перша причина пов’язана генетичним різноманіттям соматичних клітин у природі (різний рівень плоїдності, химеризм). В клітинах меристемних тканин рослин на різних етапах онтогенезу може відбуватися ендореплікація хромосом і формування тканин з різним рівним плоїдності. Міксоплоїдія і химеризм особливо часто зустрічаються в апоміктичних і вегетативно розмножених рослин. Химерні тканини складаються з генетично неоднорідних клітин, які можуть різнитися ядерними генами, числом хромосом. Генами пластид або мітохондрій.

Існує класифікація типів химерних тканин рослин:

  1. Мозаїчні (гіперхемерні) – генетично різні тканини утворюють мозаїчну структуру.

  2. Секторіальні – різнорідні тканини розташовані окремими великими ділянками.

  3. Периклинальні – танини, розташовані одна над одною.

  4. Мериклинальні – суміш сектроріальних і периклинальних ділянок тканин.

Прикладами химеризму можуть служити характер забарвлення, строкатолистість пеларгонії і хлорофітуму, що обумовлено різним числом шарів меристем точки росту, які приймають участь в утворенні листка.

Химеризм, міксоплоїдія, спонтанні поліплоїди виникають в результаті природних або штучних мутацій, а вегетативне розмноження зберігає набуті зміни в рослинах-регенерантах. Хромосомні перебудови спостерігаються також при зміні умов вирощування (підвищенні або пониженні температури, високі дози мінеральних добрив, засолення, поранення, пестициди та ін.), які приводять до фізіологічних порушень і аномальних мітозів.

Багато клонів винограду, які створені прородою шляхом брунькових мутацій з одного сорта-засновника, відібрані і виділені людиною в окремі високоякісні сорти (наприклад, Шасла біла, Шасла мускатна, Шасла рожева та ін.). У картоплі теж може відбуватися накопичення соматичних мутацій, а індукція ін віво або ін вітро адвентивних пагонів дозволяє одержати нові форми рослин.

Висновок: 1. таким чином генетична гетерогенність соматичних клітин експланту материнської рослиниє однією з причин сомаклональної мінливості і обгрунтовує ймовірність виникнення нових генотипів сомаклонів. Вирішальну роль у регуляції цих процесів в умовах ін вітро відіграють фітогормони поживного середовища.

2. Порушення фітогормонального балансу (ауксин/цитокінін) впливає на тип морфогенезу, змінює мітотичний процес і призводить до змін у хромосомах ядра, виникнення сомаклональних варіантів ін вітро підтверджують фізіологічну гіпотезу мутаційного процесу, яка ще у 1946 році була запропонована М.Лобашевим, а сьогодні символізує сучасний період вивчення природи мутацій. Різні фізичні і хімічні фактори (температура. Випромінювання, дисбаланс регуляторів росту, хімічні агенти, тощо) спочатку викликають фізіологічні зміни в клітинах (порушення мітозу, мейозу, типу морфогенезу), що приводить клітини до передмутаційного стану.

Частота виникнення сомаклональних варіантів не перебільшує 4-6%. З метою збільшення частоти і розширення спектру сомаклональної мінливості використовують мутагени (нітрозометилсечовину, 1,4-біс-діазоацетилбутан та ін.).

5. Актуальність впроводження об’єктивних методів ідентифікації сомаклонів обумовлена широким спектором фенотипових і генетичних змін у рослин-регенерантів багатьох видів рослин. В практиці найбільш поширені такі методи ідентифікації: морфологічний, цитогенетичний, метод білкових маркерів і вивчення фрагментів ДНК.

^ Морфологічний метод базується на ідентифікації сомаклонів за зовнішніми (морфологічними) ознаками: висота рослини, розмір, форма і колір листків, квітів, плодів, насіння, фертильність, урожайність, стійкість до хвороб та ін.

^ Цитологічний аналіз передбачає вивчення числа і морфології хромосом сомаклонів, що дозволяє одержати найбільш переконливі і предметні докази поліплоїдності або міксоплоїдності рослин-регенерантів. Для цитогенетичних досліджень використовують тиснуті препарати з молодих корінчиків рослин або пророслого насіння довжиною 1-2 см. При цьому слід врахувати періодичність мітозів і проводити фіксацію матеріалу з певними інтервалами, щоб «вловити» пік мітотичного ділення. Аналізують також калусні тканини в період їх активного поділу, клітини суспензійної культури, протопласти.

^ Методи білкових маркерів базуються на генетичній обумовленності синтезу білків (ферментів), що дозволяє використовувати їх як специфічні індикатори генотипу.

^ Електроферетичні варіанти білків та ізоферменти – це маркери, за якими тестують належність рослин до виду, біотипу, сорту; встановлюють ступінь спорідненості рослин; виявляють генетичну гетерогенність морфологічно однорідних популяцій. У деяких випадках з допомогою ізоферментів вдається виявляти деякі мутації на молекулярному рівні.

^ Аналіз ДНК шляхом рестрикції і гібридизації широко використовують для виявлення і вивчення організації послідовностей ДНК після їх електрофоретичного розділення. Аналіз специфічних нуклеотидних послідовностей, їх консервативних повторів, які гомологічні певному ДНК-зонду, допомагає «ловити» генетичні перебудови у сомаклонів.

За деякими характеристиками (велике число копій на геном, тандемна організація, видоспецифічність спейсерних послідовностей) гени рибосомальної РНК є найбільш зручними маркерамигеномів. Клонування таких послідовностей найчастіше застосовується як ДНК-зонди.

Сомаклональна мінливість - це джерело формоутворення і сортополіпшення важливих сільськогосподарських, декоративних, лікарських і технічних культур. На початку 70-х років нашого століття вперше із культури клітин цукрової тростиниодержані сомаклони, які різнились за морфологічними ознаками, цитологічними характеристиками та ізоферментними спектрами. На сьогодні важко назвати сільськогосподарську культуру, від якої ще не одержані сомаклональні варіанти або не проводяться роботи в цьому напрямку.

Таким чином, перспектива використання сомаклонів оптимістична, тому що вони у ряді випадків переважають вихідний сорт за цінними господарчими ознаками. Наприклад, у культурі солодкої картоплі був знайдений клон із однією новою комерційною ознакою – бульби мале більш темне і стабільне забарвлення. Рослини-регенеранти з цього клону дали початок новому сорту картоплі Скарлет.

Одержання рослин шляхом соматичного ембріоїдогенезу є складним циклічним процесом формування і культивування ембріоїдів на штучних поживних середовищах з наступною адаптацією рослин у грунті. Для захисту біологічного матеріалу і полегшення маніпуляції при роботі з ним вчені констроюють так зване штучне насіння – капсульовані соматичні ембріоїди. Вже розроблені перші методики одержання штучного насіння для моркви, люцерни, селери та інших культур.

Методика складається з таких етапів:

  1. Індукція і одержання соматичних ембріоїдів.

  2. Капсулювання соматичних ембріоїдів у гідрогелеві кульки альгінату кальцію.

Кожна капсула містить 2-3 ембріоїда, а також поживні і біологічно активні речовини. Спроби одержання рослин із капсульованих соматичних ембріоїдів у грунті потребують розробки поверхневих плівок, які утримують воду і забезпечують стерильність всередині капсули. Проводяться дослідження на додавання до капсули симбіотичних мікроорганізмів для азотфіксації. Найбільш перспективні такі напрямки вивчення сомаклональної мінливості: спрямована селекція сомаклонів, індукований мутагенез ін вітро, трансформація і перенос окремих генів.


Лекція 6.

Тема: Одержання та культивування протопластів рослин.


  1. Виділення і культивування протопластів;

  2. Гібридизація соматичних клітин шляхом злиття ізольованих протопластів (соматична гібридизація рослин);

  3. Методи злиття протопластів;

  4. Аналіз соматичних гібридів



1. Структуру рослинної клітини можна умовно розділити і розглядати як дві важливі складові частинивміст і оболонка. Перша – протопласт включає ядро і цитоплазму, в якій знаходяться органели. Друга – оболонка (клітинна стінка), хімічну основу якої визначають полісахариди (целюлоза, геміцелюлоза і пектинові речовини).

Протопласти (від грецьк. protos – перший, plastos – утворений, виліплений) – клітини, які позбавлені своєї клітинної оболонки. Їх можна характеризувати як відокремлені мембраною ядро і цитоплазматичні утворення з власною структурною цілісністю і здатністю здійснювати активний метаболізм, біосинтез і трансформацію енергії.

В експерементальній цитології і фізіології рослин протопласт виявляється як морфологічно відокремлене утворення при плазмолізі: протопласт у гіпертонічному розчині віддає воду, зменшується в об’ємі і відокремлюється від клітинних стінок (згортається у клубок). Такого роду методи ізоляції протопластів називають механічними. Наприклад, якщо смужку епідермісу цибулі витримати у 0,5М розчині сахарози до явного плазмолізу, а потім розрізати його тонким лезом, то можна спостерігати вихід протопластів у середовище. Механічний метод виділення протопластів має незручності і недоліки, серед яких необхідно відмітити такі:

Інший спосіб був запропонований англійським вченим Е.Кокінгом, який у 1969 році за допомогою спеціальних ферментів руйнував целюлозно-пектинову оболонку і одержував «голі» клітини – протопласти. Після вдалих робіт І. Такебе (1971) ензиматичний метод знайшов широке застосування при виділенні протопластів у багатьох лабораторіях світу. Переваги методу переконливі:

Для ізолювання протопластів використовують суміші різних ферментів, дія яких спрямована на гідролітичне розщеплення полісахаридних компонентів клітинних стінок. Ці ферменти мають відповідні назви – целюлази, геміцелюлази, пектинази.

Успішне виділення протопластів залежить від багатьох факторів: типу тканини (листок, корінь, калус, пилкові зерна, пелюстки тощо), виду і фізіологічного станурослини, складу фементів і їх концентрації, часу обробки тканин ферментами, вибору осматичного стабілізатора (глюкоза, сахароза, маніт, сорбіт), рН середовища і температури. Середовище повинно бути кислим (рН 5,4-6,2), а головне – трохи гіпертонічним (0,3-0,8 моль/л), щоб протопласти знаходились у невеликому стані плазмолізу (при таких умовах гальмується метаболізм і не відбувається швидка регенерація клітинної стінки). Крім того, таке середовище стримує тургор і не дозволяє клітинам лопатись. Використовують молоді листки рослин, ттому що в їх міжклітинній речовині переважно міститься пектин.


2. Протопласти – «голі» клітини – можуть зливатися і утворювати гібридний протопласт, який поступово «одягається» (будує свою клітинну стінку), ділиться і спроможний стати гібридною рослиною шляхом ембріоїдогенезу або органогенезу.

^ Соматична гібридизація (синонім – парасексуальна гібридизація) – гібридизація соматичних клітин шляхом злиття їх ізольованих протопластів (англ. Fusion of protoplasts).

Застосування методології злиття протопластів дозволяє соматично схрещувати філогенетично віддалені види рослин, а також створювати додаткові резерви спадкової мінливості. У нинішній час селекціонер мало зацікавлений у тому, щоб зробити дикі форми культурними. Для нього набагато важливіше передати від «дикуна» до культурної форми окремі гени, які можуть надати стійкості культурним рослинам до біотичних і абіотичних факторів довкілля.

Р.Г. Бутенко і А.А. Кучко (1977) одержали фертильний соматичний гібрид між диким і культурним видами ^ Solanum chacoence та S. Tuberosum, який характеризується стійкістю до вірусу У. Цей гібрид застосовується у подальших селекційних схрещуваннях.

Для декоративного садівництва викликають інтерес соматичні гібриди Дж. Пауера між видами ^ Petunia parodi і P. parvifolia, які статевим шляхом не схрещуються. Цим способом до селекції залучено нову ознаку «розгалужений пагін, що стелеться». Х. Шенх одержав соматичний гібрид між капустою і турнепсом (перко). Аналогічних прикладів можна навести дуже багато.

Методами парасексуальної гібридизації створені міжродові та міжтрибні гібриди. Особливий науковий інтерес викликають міжцарственні клітинні гібриди, які одержують шляхом злиття протопластів рослиннтх і тваринних клітин; наприклад , протопластів еретроцитівщура і дріжджових клітин, протопластів моркви і людини та ін. Одержати рослинно-тваринні «монстри» не вдається тому, що еволюційно закріплений консерватизм передачі спадкової інформації усуває негомологічні хромосоми у метафазі першого мейозу і подальше ділення неможливе.

^ Соматичні цибриди. Спадкова інформація рослинної кліттини зберігається в геномі (хромосомах ядра) і цитоплазмоні (ДНК хлоропластів і мітохондрій). Існують методи вилучення або інактивації ядра, що приводить до одержання протопластів без ядра – цитопластів. При злитті протопласті і цитопласта утворюється соматичний цибрид. Таким чином, генетична основа соматичного цибрида може складатися з елементів двох цитоплазмонів і одного із ядер батьківських протопластів. Саме тому метод соматичної гібридизації дозволяє одержувати такі форми рослин, що відрізняються сукупністю генів від статевих гібридів, а також створювати нові унікальні комбінації генів (цитоплазматичні гетерозиготи).

Наприклад, при злиттті протопластів мезофілу томатів і картоплі були одержані соматичні гібриди, які диференціювали за білковими маркерами на два типи: «помати» (з пластидами від картоплі) і «топати» (з пластидами від томатів).

Спеціалісти вважають, що у гібридів, які об’єднують елементи цитоплазми обох батьків і мають ядро одного з них, перспективне майбутнє. При злитті цитоплазмонів можуть відбуватися рекомбінації мітохондріальних або хлоропластних ДНК, які приводять до створення нових генотипів.

Після одержання соматичних гібридів або цибридів необхідно проводити біохімічний і цитологічний аналіз батьківських форм і гібридів першого покоління за спеціальними методиками (питання 4.).


^ 3. Методи злиття протопластів.

Протопласти несуть негативний поверхневий заряд, що призводить до їх взаємного відштовхування. Тому для об’єднання проттопластів необхідно це відштовхування подолати або усунути.

Розроблені і практично виколристовуються два основних методи злиття – хімічний і електричний.

^ Хімічний метод передбачає обробку протопластів поліетеленгліколем (ПЕГ), а потім – буферним розчином з високим вмістом Са2+, рН 10,5. В інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України методику індукції злиття протопластів так і називають: «ПЕГ – високий рН – високий Са2+ (Момот В.П., Кучук М.В., Пастернак Т.П., 1988). Додавання ПЕГ до батьківських протопластів приводить до їх злипання в результаті дегідратації.

Поглинання вільної води призводить до утворення отворів по всій поверхні плазмалеми і відбувається перетікання внутрішньоклітинного матеріалу.

На початку 80-х років був розроблений метод електрозлиття протопластів (Ватс Д, Кинг Дж., 1984; Хан-Хагердал В., Борнман Х., 1986). Протопласти суспензують між двома електродами. При дії змінного струму проходить діелектрофорез і протопласти шикуються у ряд таким чином, що приєднуються своїми полярними поверхнями один до одного. Потім накладають сильний імпульс постійного струму (600в/см 10-20 мкс), який обумовлює утворення отворівв ущільнених мембранах. У місцях контактів протопластів утворюються містки, по яких відбувається перетікання цитоплазм у вигляді міжпротопластного обміну. Успіх культивування продуктів злиття протопластів залежить від їх здатності синьезувати нову оболонку, ділитися і давати початок регенерантам.

Природа злитття протопластів остаточно не з’ясована і активно вивчається.


4. Для підтвердження гібридної природи отриманих у результаті злиття клітинних агрегетівррослин-регенерантів необхідне проведення цитологічного, біохімічного і молекулярногенетичного аналізів.

^ Цитологічний аналіз.

Гібриди часто аналізують методами, тобто досліджують кількість і морфологію хромосом. Цей метод достовірний, особливо для міжтрибних, міжродинних гібридів, для батьків яких властива докорінна морфологічна відмінність хрромосом. Причини генетичної нестабільності соматичних гібридів цілком не з’ясовані. З одного боку вони можуть бути наслідком філогенетичної віддаленості вихідних видів, з іншого – вцей процес можуть бути включені й інші чинники. Тривалість індукції і пасажування калюсу соматичних гібридів, склад живильних середовищ також впливає на цитологічну нестабільність.

^ Біохімічний аналіз.

Біохімічні методи широко застосовують для агналізу міжвидових гібридів. Вивчають їх за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі з наступним фарбуванням білків із визначеною ферментативною активністю – це є найпростішим і найефективнішим засобом біохімічного аналізу парасексуальних гібридів. Одним із найдостовірніших та найдоступніших методів біохімічного дослідження соматичних гібридів є аналіз РубісКО. Це найпоширеніший і найбільш вивчений білок рослин, що є ключовим ферментом циклу Кальвіна і складається з великих і малих субодиниць. Поліпептиди великих субодиниць кодуються хлоропластною ДНК, малих – ядерною ДНК. Вивчення поліпептидного складу субодиниць за допомогою ізоелектрофокусування в поліакриламідному гелі дає змогу виявити розходження в будові поліпептидних білків різних видів рослин.

^ Молекулярно-генетичний аналіз.

Використання рестрикційного аналізу ДНК для дослідження хлоропластів і мітохондрій соматичних гібридів має переваги – можливість виявлення перебудови ДНК, цілого геному. На відміну від ДНК пластид аналіз ДНК мітохондрій за соматичної гібридизації показує, що у вищих рослин можлива рекомбінація між геномами мітохондрій.


Лекція 7.


4074869064076941.html
4075037554421594.html
4075124665602440.html
4075203813879916.html
4075320521515576.html